V hodnocení polní rezistence genotypů řepky olejky ozimé (Brassica napus L.) k chorobám jsou pro zesílení infekčního tlaku používány inokuláty připraveny z izolátů významných patogenů řepky.

Mezi ně rozhodně patří původci fomového černání stonku řepky patogeny Leptosphaeria maculans a Leptosphaeria biglobosa.

V rámci prováděných hodnocení byla zjišťována rozdílná reakce genotypů řepky na plošnou inokulaci izoláty sledovaných patogenů. Získané poznatky byly konfrontovány s prozatímními výsledky klasifikace virulence patotypů L. maculans a genetickým založením odolnosti řepky k nim. Cílem bylo posouzení jejich využití ve šlechtění řepky olejky na odolnost k fomovéhu černání stonku řepky.

 

Metodika a materiál

 

Izolace patogenů a příprava inokulátu

Inokuláty byly vyrobeny z izolátů patogenů Leptosphaeria maculans, L. biglobosa (obr. 1 a 2) získaných z pletiv řepky odebraných v různých oblastech České republiky. Pro izolaci patogenů Leptosphaeria spp. jsme použili infikované listy. Část pletiva s typickými projevy napadení (skvrny s pyknidami) byla povrchově sterilizována v 20% roztoku SAVO po dobu 3 minut a třikrát opláchnuta v destilované vodě. Poté bylo pletivo uloženo do vlhké komůrky. Po dvou dnech inkubace při laboratorní teplotě jsme přemístili jednu pyknidu (monopyknidiální izolace) nebo uvolněný sorus pyknospor ze skvrny pomocí sterilní jehly na Petriho misky s živnou půdu (PDA nebo V8 juice agar). V tomto kroku jsme pracovali v laminárním boxu se stereomikroskopem, s jehož pomocí jsme odebírali jednotlivé pyknidy. Každou Petriho misku jsme po obvodu přelepili parafilmovou páskou a popsali. Po nárůstu mycelia z pyknid jsme izoláty rozočkovali. Každá Petriho miska byla popsána a ošetřena parafilmovou páskou. Izoláty byly kultivovány při laboratorní teplotě cca 20 °C. Za 14 až 21 dní po nárůstu mycelia byly izoláty použity k přípravě inokulátu. Na živné půdě V8 juice byl růst a vývoj patogenů rychlejší (Plachká a dal., 2017).

 

Inokulát byl připraven ze směsi patogenů izolovaných z různých lokalit. Houba byla přenesena z Petriho misky pomocí sterilního skalpelu i s pevnými částečkami živné půdy do mixéru. Poté byla rozmixována s destilovanou vodou a doplněno na 1,0 l směsi inokulátu s destilovanou vodou. Pro stanovení koncentrace byla použita klasická metoda stanovení koncentrace spor pomocí Bürkerovy komůrky. Princip stanovení spočívá v počítání spor houby v přesně vymezeném objemu, který je ohraničen mřížkou. Spočítali jsme spory ve stech tzv. velkých čtvercích o ploše 1/25 tj. 0,04 mm². Konečný počet spor (p) se vypočte dle vzorce:

 

p_x= (p₁₀₀ / V₁₀₀) x 1000

 

p_x je počet spor v 1 mm³ (tj. v 1 ml)

p₁₀₀ je počet spor v počítaných 100 políčkách

V₁₀₀ je objem počítaných 100 políček (100 × 1/25 × 0,1= 100 × 0,04 × 0,1 = 0,4 mm³).

 

Ideální koncentrace konidiospor v inokulátu LEPTMA je 5 - 23 × 10⁶ spor v 1 ml suspenze. 1 l roztoku inokula této koncentrace spor v 1 ml je dostačující pro přípravu inokulátu na plochu 10 arů (Plachká a další 2014). Použitý inokulát měl koncentraci 5,28 × 10⁶ spor.

 

 

Hodnocení zdravotního stavu

Hodnocení probíhala ve šlechtitelských (odrůdových) maloparcelových pokusech, které byly založeny dle zásad Metodiky zkoušek užitné hodnoty - brukvovité olejniny, ZUH/4-2019 (Zehnálek, 2019). Pokus byl standardně plošně ošetřován herbicidy, insekticidy a na jaře přihnojen dusíkem a sírou, ledkem amonným s vápencem a síranem amonným. Ošetření inokulátem bylo provedeno na podzim 2018. Před sklizní bylo provedeno vyhodnocení napadení patogeny Leptosphaeria maculans, L. biglobosa. Hodnocení bylo prováděno také dle uvedené metodiky. Definice stupňů hodnocení: 9 – bez výskytu choroby, 1 – více než 50 % rostlin má alespoň jednu skvrnu na hlavním stonku, většina skvrn obepíná více než 80 % stonku.

 

 

Materiál

 

Pracovali jsme s genotypy řepky olejky ozimé kvality 00 (nízký obsah glukosinolátů a kyseliny erukové). Celkem bylo hodnoceno 243 genotypů řepky olejky ozimé. Plošně inokulováno bylo 58 genotypů v mezistaničních zkouškách (MZ) a 185 genotypů ve zkouškách výkonů (ZV). Inokulát se skládal ze 3 izolátů patogenu L. maculans.

Polní testy byly založeny na lokalitě Komárov (okres Opava). Lokalita se nachází v řepařské výrobní oblasti. Dlouhodobé údaje teploty a srážek (1981 – 2010): průměrná denní teplota 8,6 °C, roční úhrn srážek 567,6 mm.

 

 

Statistické posouzení

Byly posouzeny vzájemné vztahy mezi napadením a výnosem a také mezi výnosy u inokulovaných a neinokulovaných parcel. Tabulky a grafy byly zpracovány pomocí programu EXCEL 2013. Kritické hodnoty koeficientů korelace pro hodnocený počet členů 58 jsou pro P_0,01 = 0,33; P_0,05 = 0,33 a pro hodnocený počet členů 185 jsou pro P_0,01 0,21 a P_0,05 0,16 (Rod, Vondráček 1975).

 

Výsledky

V hodnocení vlivu inokulace na zdravotní stav genotypů řepky olejky v MZ byly sledovány tyto parametry:

ZDRAVOTNÍ STAV

Průměrné hodnoty stupně napadení byly 4,64 na neinokulovaných parcelách a 4,59 na inokulovaných parcelách v MZ a 4,51 a 4,70 stupně ve ZV. U inokulovaných parcel bylo zaznamenáno v obou polních testech o něco nižší napadení po inokulaci. Rozdíly byly ale minimální (do 0,21 stupně).

 
Z 58 hodnocených genotypů v MZ bylo zvýšené napadení o 0,5 a více stupně zaznamenáno po inokulaci patogeny u 36 % genotypů v MZ. Ve zkouškách výkonů 23 % z hodnocených genotypů.

 

Korelace mezi stupni napadení inokulovaných a neinokulovaných parcel dosáhly hodnoty 0,45499 v MZ a 0,58406 ve ZV.

 

 

VÝNOS

 

V hodnocení vlivu inokulace na výnos bylo zaznamenáno po inokulaci zvýšení výnosů u 44 % genotypů. Uvedené bylo potvrzeno posouzením korelace mezi výnosy neinokulovaných k inokulovaným parcelám, kde bylo dosaženo těchto hodnot korelačních koeficientů 0,66123 v MZ a 0,7379973 ve ZV. V hodnocení vlivu napadení na výnos nebyla potvrzena korelace. Korelační koeficienty se pohybovaly mezi -0,00738 až 0,079127.

 

Výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

 

Shrnutí

V ročníku 2018/2019 byl zaznamenán stejný trend vlivu plošných inokulací na zdravotní stav a výnos jako v předcházejících letech (Plachká a další, 2018). Vedle vnějších podmínek prostředí/lokality na výsledky plošných inokulací byla důležitá odolnost hodnocených genotypů k fomovému černání stonku řepky.

 

Odolnost řepky k fomovému černání stonku řepky je mimo vnější vlivy daná geny rezistence. Identifikace genů rezistence v českých odrůdách a určení úrovně jejich kvantitativní rezistence k původcům fomového černání stonků řepky je náplní řešení projektu NAZV MZe: QK1710397 Charakterizace kompatibility vztahů mezi původci fomového černání stonku a odrůdami ozimé řepky jako základ pro zvýšení rentability pěstování této plodiny v ČR. V rámci tohoto projektu bylo zatím testováno celkem 136 různých izolátů získaných z lézí na listech komerčních odrůd řepky, které byly sbírány v období září - listopad 2017 a duben až listopad 2018. Pomocí inokulačních testů byly testovány následující geny avirulence: AvrLm1, AvrLm3, AvrLm4, AvrLm7, AvrLm2 a AvrLm9. Z výsledků vyplývá, že nejvíce byl zastoupen gen pro avirulenci AvrLm7, který se vyskytoval v 96,3 % izolátů, tj. u 131 testovaných izolátů. Při porovnání kombinací jednotlivých avirulentních genů bylo nalezeno 105 izolátů L. maculans, které měly pouze gen avirulence AvrLm7. Další avirulentní geny jsou v porovnání s AvrLm7 minoritní (PLACHKÁ a dal. 2019 v tisku).

 

Pozitivní vliv napadení řepky olejky původci fomového černání na výnos může být dán vedle odolnosti také dobou napadení. Ta významně ovlivňuje jeho škodlivost. V případě časných infekcí na podzim s projevy fomového černání na kořenech již před zimou, může u náchylných genotypů dojít k projevům nouzového dozrávání již v době růstů šešulí. V tomto případě je vysoce pravděpodobné, že napadení bude mít negativní vliv na výnos. V případě pozdních napadení nebo odolných respektive tolerantních genotypů řepky dochází k nouzovému dozrávání až na konci zrání řepky. V tomto případě může napadení působit jako přirozený desikant a nedojde ke snížení výnosu.

 

Získané poznatky ukazují, že komplexní hodnocení odolnosti řepky k fomovému černání stonku řepky vyžaduje zařazení klasifikace genů odolnosti řepky a genů avirulence patotypů patogenu Leptosphaeria maculans pomocí biotechnologických metod.

 

 

Tabulka 1: Průměrné hodnoty napadení řepky olejky Leptosphaeria maculans, L. biglobosa před sklizní, výnos, 2018/2019, lokalita Komárov

	Napadení (UKZUZ 9-1)		Výnos (kg/10 m2)
Inokulace	Ne	Ano	Ne	Ano
Mezistaniční zkoušky (MZV)	4,64	4,59	3,15	3,12
Staniční zkoušky (ZV)	4,51	4,70	3,75	3,78

 

Tabulka 2: Posouzení vztahů mezi zdravotním stavem a výnosem řepky olejky po inokulaci patogeny Leptosphaeria maculans, L. biglobosa, 2018/2019, lokalita Komárov (koeficienty korelace)

Zkoušky výkonů	Zdravotní stav Inokulace ne × ano	Napadení a výnos Inokulace		Výnos Inokulace ne × ano
		Ne	Ano
Mezistaniční	0,45499	0,02866	-0,00738	0,66123
Staniční	0,58406	0,079127	0,072787	0,737973

Obrázek 1: Izolát patogenu Leptosphaeria maculans, Opava – Kylešovice, rok sběru 2006

Obrázek 2: Izolát patogenu Leptosphaeria biglobosa, Olomouc, rok sběru 2000

Dedikace

Získání výsledků bylo finančně podpořeno MZe prostřednictvím institucionální podpory MZe RO1818 a řešením projektu NAZV QK 1710397.

 

 

Seznam použité literatury

Rod J., Vondráček J. 1975: Polní pokusnictví, Pokusnická technika se základy biometriky. Vysoká škola zemědělská v Brně. SPN, 1975. Praha. 1. vydání. S. 232

 

Plachká, E., Poslušná, J., Macháčková, I. 2014. Příprava inokulátů Leptosphaeria spp. a Sclerotinia sclerotiorum pro plošné polní inokulace řepky olejky (Brassica napus). Certifikovaná metodika (ÚKZÚZ 097221/2014). OSEVA vývoj a výzkum s.r.o., 2014. s. 32

 

Plachká, E., Poslušná, J., Macháčková, I. 2014. Aplikace inokulátů Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria biglobosa a Sclerotinia sclerotiorum v polních testech rezistence řepky a zkoušek přípravků na ochranu rostlin. Certifikovaná metodika (ÚKZÚZ 097224/2014). OSEVA vývoj a výzkum s.r.o., 2014. s. 36.

 

Plachká E., Poslušná J., Mazáková J. 2017: Testování citlivosti/rezistence houbových patogenů řepky olejky – Sclerotinia sclerotiorum, Leptosphaeria maculans a L. biglobosa k fungicidům. Certifikovaná metodika (UKZUZ 008216/2017). OSEVA PRO s.r.o., oz VÚO Opava. 2017. 32. s.

Plachká E., Vrbovský V., Macháčková I., Šmirous P., Šafář J. 2018: Využití plošných polních inokulací ve šlechtění řepky olejky ozimé. http://rostlinyprobudoucnost.com

Plachká E., Vrbovský V., Rychlá A., Burgetová M., Jindřichová B., Burketová L., Fajemisin O., Mazáková J., Ryšánek P.: 2019: Hodnocení významu fomového černání ve šlechtění a pěstování řepky olejky ozimé v ČR a monitoring genů avirulence v populacích Leptosphaeria maculans. 36. Vyhodnocovací seminář Systém výroby řepky a Systém výroby slunečnice, HLUK, 20. – 21. 11. 2019, SPZO s.r.o., Svaz pěstitelů a zpracovatelů olejnin, Praha. V tisku.

 

Autoři:

Eva PLACHKÁ; OSEVA PRO s.r.o., oz Výzkumný ústav olejnin Opava, Purkyňova 10, 746 01 Opava, Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.
Viktor VRBOVSKÝ; OSEVA PRO s.r.o.., oz Výzkumný ústav olejnin Opava, Purkyňova 10, 746 01 Opava

Markéta Burgetová, OSEVA vývoj a výzkum s.r.o., provozovna Opava, Purkyňova 1653/10, Opava