Rhizobia patří mezi gramnegativní půdní bakterie, které jsou schopné redukovat molekuly vzdušného dusíku na amoniak a zabudovávat jej do aminokyselin. Tyto bakterie vstupují do symbiotického vztahu s rostlinami z čeledi bobovitých, na jejichž kořenech vytvářejí hlízky, ve kterých dochází pomocí enzymu nitrogenázy k biologické fixaci vzdušného dusíku. Tento proces má nezastupitelný význam při koloběhu dusíku v přírodě a jeho využití v zemědělství je lépe ekologicky udržitelné než aplikace dusíkatých hnojiv
(1).
Experimenty, při nichž jsou využívány kmeny rhizobií, bývají obvykle dlouhodobějšího charakteru, a proto je vhodné zvládnout techniky dlouhodobého uchovávání těchto bakterií. Jejich účelem je zachovat životaschopnost rhizobií a minimalizovat riziko mutací, aby nedošlo ke ztrátě jejich žádoucích vlastností buď během skladování, nebo při opakovaném přeočkování do nového média.
Krátkodobé uchovávání
Metody krátkodobého uchovávání jsou vhodné především během procesu izolace jednotlivých kmenů rhizobií z kořenových hlízek, dokud nejsou kmeny jednoznačně identifikovány a charakterizovány.
Pro uchování v řádu jednotek dnů lze rhizobia uchovávat na Petriho miskách nebo na šikmém agaru na pevném médiu v termostatu při 30 °C, poté je nutné bakterie přeočkovat na nové médium.
Pro uchovávání v řádu týdnů lze zvolit uchování na pevném médiu v Petriho miskách nebo na šikmém agaru při chladničkové teplotě. V tomto případě je ale nutné dát pozor na postupné vysychání média a na možnost odumření bakteriální kultury.
Dlouhodobé uchovávání
Metody dlouhodobého uchovávání jsou vhodné pro práci s rhizobiálními kmeny, u nichž již byla provedena jejich charakterizace a u kterých je žádoucí zachovat jejich genetické, biochemické a fyziologické vlastnosti.
Lyofilizace
Jednou z metod dlouhodobého uchovávání bakterií je lyofilizace, při níž dochází k vysušení bakteriální kultury mrazem za sníženého tlaku při použití vhodného kryoprotektiva (dimethylsulfoxid, glycerol, albumin, pepton). Při tomto procesu může dojít k narušení bakteriálních buněk, a tím i ke snížení viability kultury, na druhou stranu s lyofilizovanými bakteriemi se snadno manipuluje a lze je v tomto stavu uchovávat neomezeně dlouho.
Zamražení
Šetrnou metodou dlouhodobého a uchovávání rhizobií je jejich mražení, kdy jsou bakterie uchovávány v kryokonzervačním roztoku skládajícím se z tekutého kultivačního média a kryokonzervantu (např. glycerol, dimethylsulfoxid) a následně jsou skladovány při nízkých teplotách. Při teplotě -80 °C (hlubokomrazící boxy, boxy se suchým ledem) bakterie přežívají měsíce až jednotky roků, při -196 °C (uchovávání v tekutém dusíku) lze kultury skladovat neomezeně dlouho.
Zamražení na skleněných kuličkách
Při dlouhodobém uchovávání rhizobií je možné při zamražení použít skleněné kuličky, které se přidávají do kryotuby k suspenzi bakterií v kryoprotektivním roztoku. Tento způsob zamražení přináší tu výhodu, že při následném rozmrazování není nutné použít celou zamraženou dávku bakterií, ale pouze jednu, nebo několik jednotlivých kuliček. Jedna kryotuba tedy poskytne dávku na několikanásobné rozočkovaní bakterií, přičemž se vyhneme riziku poškození kultury opakovaným rozmrazováním a zamrazováním dané kryotuby.
Podle potřeby je možné zvolit již předplněné kryotuby s kuličkami, nebo vybrat vhodnou velikost kuliček podle objemu kryotuby a podle požadovaného počtu rozmražených dávek bakterií.
Obrázek 1 Rozdílné počty kuliček při objemu 1 ml v kryotubě.
Při mražení je suspenze bakterií v kryoprotektivu přenesena do kryotuby s kuličkami a vše je opatrně, ale zároveň důkladně promícháno tak, aby byly kuličky rovnoměrně obaleny v suspenzi. Přebytek suspenze je možné odsát a v kryotubě ponechat pouze množství nezbytné pro pokrytí kuliček, což usnadní uvolňování jednotlivých kuliček při rozmrazování. Následně je kryotuba přenesena do hlubokomrazícího boxu s teplotou -80 °C, nebo do dewarovy nádoby s tekutým dusíkem s teplotou -196 °C.
Obrázek 2 Kryotuby s kuličkami o průměru 2 a 3 mm obalenými bakteriální suspenzí.
Při následném rozmrazení bakterií jsou kryotuby přeneseny do chladícího bloku, nebo jsou udržovány na ledu, aby nedošlo k rozmrznutí celého objemu kryotuby. Pomocí bakteriologické kličky je uvolněna jedna kulička (případně několik jednotlivých kuliček), která je přenesena na Petriho misku s tuhým médiem, nebo do nádoby s tekutým médiem. V případě použití tuhého média je po něm kulička kličkou válena tak, aby došlo k přenesení bakterií z povrchu kuličky na médium. Následně je miska umístěna do termostatu a rhizobia jsou kultivována běžným způsobem.
Ať už jsou používány jakékoli metody uchovávání rhizobií, jejich součástí by měly být i pravidelné kontroly kvality uchovávaných kmenů a jejich viability. Doporučuje se také, aby jednotlivé kmeny byly uchovány alespoň dvěma různými způsoby (např. v lyofilizovaném i zamraženém stavu) a skladovány na dvou oddělených místech kvůli minimalizaci rizika ztráty bakteriálních kultur (2).
Autor:
Mgr. Ing. Michaela Matoušková,
Zemědělský výzkum, spol. s r. o.
Reference:
- Trněný O, Vlk D, Macková E, Matoušková M, Řepková J, Nedělník J, et al. Allelic Variants for Candidate Nitrogen Fixation Genes Revealed by Sequencing in Red Clover (Trifolium pratense L.). Int J Mol Sci [Internet]. 2019 Nov 2 [cited 2019 Nov 18];20(21):5470. Available from: https://www.mdpi.com/1422-0067/20/21/5470
- Howieson JG, Dilworth MJ. Working with rhizobia [Internet]. Murdoch University. Canberra: Australian Centre for International Agricultural Research; 2016. 314 p. Available from: http://aciar.gov.au/files/aciar_mn_173_web-updated_31_may_2016.pdf