Identifikace odrůdy je v ovocnářství velice důležitá. Tradičně se provádí pomocí fenotypového a fenologického hodnocení, které může být jednak časově velmi náročné, ale v některých případech z důvodu velkého množství odrůd dokonce nemožné.
Také je pro takové hodnocení často vyžadováno hodnocení celého stromu a nestačí vzorek např. jen plod či list. Naopak tomu je u molekulárně biologických metod, které se v dnešní době stále více prosazují. Ty jsou rychlé, spolehlivé a vyžadují jen malé vzorky pletiva, proto je možné provést identifikaci kultivaru například jen z jednoho listu či plodu.
Jednou z nejvýznamnějších a nejprodukovanějších ovocných plodin je jabloň domácí (Malus domestica × Borkh.), u které se odhaduje, že celosvětově existuje více než 30 tisíc kultivarů. Šlechtitelské programy navíc neustále produkují kultivary nové, proto jsou z důvodu stále zvyšujícího se množství kultivarů pro genotypování jabloní vhodné molekulárně biologické metody.
Pro genotypování jabloní je vhodné využít analýzu tzv. SSR markerů (simple sequence repeat), což jsou krátké repetitivní sekvence dlouhé 2 až 6 nukleotidů, kdy počet repetic se liší mezi jednotlivými kultivary. Kombinací délek několika SSR markerů pak vzniká genetický profil, který je jedinečný pro daný kultivar. SSR markery jsou vysoce informativní, multialelické, jejich analýzu lze snadno standardizovat a výsledky porovnávat mezi laboratořemi. K samotné analýze je potřeba izolovaná DNA z pletiva; u jabloně se nejčastěji využívá list, lýko, nebo čerstvý plod, ale určení odrůdy lze provést i z jiných částí stromu nebo ze zpracovaného ovoce (např. křížaly). SSR markery jsou následně analyzovány metodou fragmentační analýza, kdy jsou nejprve v polymerázové řetězové reakci (PCR) amplifikovány příslušné úseky genomové DNA pomocí specifických a fluorescenčně značených primerů, které jsou následně rozděleny dle velikosti kapilární elektroforézou na kapilárním genetickém analyzátoru, který je schopný rozlišit fragmenty lišící se i o 1 nukleotid. Běžně využívané kapilární analyzátory jsou schopné současně detekovat 5 barevných spekter, takže v jedné reakci je možné analyzovat několik SSR markerů paralelně, což identifikaci daného genotypu nejenomže zrychluje, ale také zlevňuje.
Tímto směrem se pustili i vědci z Výzkumného a šlechtitelského ústavu ovocnářského v Holovousích, kteří vyvinuli pro genotypování jabloní sadu 17 SSR markerů, které je možné analyzovat v jedné reakci. Pravděpodobnost shody dvou nepříbuzných jedinců byla pro tuto sadu stanovena na 1,73 x 10-22, což je hodnota srovnatelná s podobnými soupravami používanými pro genotypizaci u lidí. Nevýhodou sady je, že z principu nemůže být využita pro rozeznávání klonů/mutací odrůd, jelikož ty vykazují shodný genetický profil (např. 'Bohemia' je klonem odrůdy 'Rubín'). Přesto tato sada markerů vykazuje veliký potenciál pro praktické využití, kdy je vhodná například pro tvorbu referenční databáze pro účely ověřování a identifikace odrůd ve školkařské praxi, pro prověřování produkčního řetězce jabloňových výpěstků, pro ověřování odrůdové pravosti nebo pro ověřování rodičovských kombinací při šlechtění.
[Detaily jsou uvedeny v publikacích: „A new one-tube reaction kit for the SSR genotyping of apple (Malus × domestica Borkh.)“; https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2020.110768 a „Genotypizace jabloně domácí (Malus × domestica Borkh.) pomocí SSR markerů v praxi“; https://doi.org/10.60615/dnp4-0x57]
Autor: Kamila Pluhařová
VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o.