Falešná odrůdová deklarace u banánů (Musa spp.) poškozuje důvěru trhu i peněženky odběratelů. Kombinace DNA barcodingu, SSR a SNP markerů umožňuje rychlou a levnou kontrolu už u „zelených“ plodů – a je prakticky realizovatelná i v podmínkách rutinní inspekce.

Úvod

Pěstitelé a prodejci potravin čelí v současné době stále častějším výzvám, které ohrožují jejich úrodu, investice i pověst (Black et al. 2016). Jedním z významných problémů je otázka odrůdové pravosti. Není výjimkou, že zákazník očekává banány určité kvality, avšak při dodávce zjistí, že část plodů neodpovídá jeho požadavkům. Takové situace vedou ke ztrátám finančním i reputačním a narušují důvěru spotřebitelů. Tento text představuje, proč jsou banány a plantainy problematické, jak fungují barcodingové přístupy, kdy sáhnout po SSR/SNP a jak celou metodiku uchopit ekonomicky i provozně.

Banány a plantainy (Musa spp.) patří mezi nejdůležitější potravinářské plodiny s celosvětovou roční produkcí přesahující 130 milionů tun (faostat.fao.org). Většina pěstovaných banánů jsou partenokarpické triploidní klony vzniklé přirozenou intra- a interspecifickou hybridizací mezi poddruhy Musa acuminata (genom A) a Musa balbisiana (genom B) (Simmonds & Shepherd, 1955). Triploidy se klasifikují do skupin AAA, AAB a ABB a zahrnují jak dezertní banány, tak plantainy (Maseko et al. 2024), které poskytují základní složku výživy milionům lidí ve vlhkých tropech. Menší část pěstovaných banánů vznikla také hybridizací genomů A a B s dalšími genomy rodu Musa, zejména S (M. schizocarpa) a T (M. textilis) (Carreel 1994; Carrel et al. 1994).

Produkce banánů je dlouhodobě ohrožena chorobami, z nichž nejvážnější hrozbu představuje Fusarium oxysporum (Ploetz 2015; Dale et al. 2017). Nejznámějším příkladem je odrůda Gros Michel, která byla v první polovině 20. století dominantní v mezinárodním obchodě. Její silnější slupka zajišťovala odolnost při přepravě, rostla ve velkých hustých hroznech vhodných k transportu lodí, a navíc vynikala bohatší, sladší a krémovější chutí než dnešní běžně dostupné banány (Maseko et al. 2024). Tato odrůda, oblíbená jak u pěstitelů, tak u spotřebitelů, však byla prakticky zlikvidována tzv. Panamskou nemocí způsobenou právě houbou Fusarium oxysporum (Soluri 2002; Dale et al. 2017).

Šíření choroby ve Střední Americe urychlili sami pěstitelé, kteří nevědomky používali infikovaný sadební materiál. Dočasně bylo možné udržet produkci otevřením nových plantáží na panenské půdě – odhadem více než 40 000 ha – ale jakmile se v 50. letech začala neinfikovaná půda tenčit, výrobní náklady prudce vzrostly. Bylo nutné najít odrůdu, která by Gros Michel nahradila, a tou se stala odolnější odrůda Cavendish. Obě tyto odrůdy spadají do triploidní skupiny AAA.

Dnes se na odrůdu Cavendish spoléhá přibližně 45 % světové spotřeby, což představuje závislost na jediném genotypu (Dale et al. 2017). Cavendish je sice méně náchylný k Panamské nemoci než Gros Michel, ale i on zůstává citlivý k novým kmenům Fusaria a dalším patogenům (Maseko et al. 2024).

Kromě chorob však pěstitelé a distributoři čelí i problému falšování odrůd. Někteří dodavatelé záměrně přimíchávají plantainy do zásilek dezertních banánů. V nezralém (zeleném) stavu jsou si plody vizuálně podobné a odhalení falšování je obtížné. Tímto postupem dodavatelé snižují vlastní náklady, avšak zákazník je poškozen – místo očekávaného dezertního banánu obdrží plody vhodné spíše k vaření. Tento problém jasně ukazuje, že je potřeba zavést metodiky, které umožní jednoznačnou identifikaci již ve fázi zelených plodů, a v případě zjištění nesrovnalostí uvalit na dodavatele sankce.

Jednou z metod, které se v posledních dvou desetiletích etablovaly pro účely identifikace druhů a odrůd, je DNA barcoding (Cau et al. 2021). Tato metoda je založena na sekvenaci standardizovaných úseků genomu, tzv. barcodingových regionů (Parveen et al. 2016). U rostlin se nejčastěji používají chloroplastové geny rbcL a matK, doplňkově také intergenové regiony jako trnH-psbA, a v některých případech jaderné sekvence, zejména ITS. Délka amplikonů bývá obvykle 500–700 bp a identifikace probíhá porovnáním s referenčními databázemi, jako jsou BOLD nebo GenBank. Pro poškozené nebo fragmentované vzorky je k dispozici varianta tzv. mini-barcodingu, při němž jsou zesilovány kratší fragmenty (100–200 bp), které si uchovávají dostatečnou taxonomickou informaci. Tato strategie se ukázala jako účinná například u herbářových položek nebo u potravin zpracovaných technologickými postupy, které DNA degradují.

Dalším rozšířením je meta-barcoding, které je založeno na amplifikaci barcodingových genů z DNA směsného původu, typicky z komplexních potravinových matric. Po následné analýze vysokokapacitními sekvenačními technologiemi NGS (Hoban et al. 2018; Flügge et al. 2023)) je možné identifikovat více taxonů současně (Cottenet et al. 2022). Tento přístup je vhodný pro detekci příměsí nebo falšování, například u sušeného ovoce, šťáv či směsí (Bruno et al. 2019), ačkoli je zatížen PCR biasem a není zcela kvantitativní. V posledních letech se uplatňuje i tzv. cílená DNA detekce, kdy jsou pro specifické polymorfismy (SNP, indely, případně úplné absence genů) navrženy primery nebo sondy a výsledná identifikace probíhá pomocí qPCR nebo digitální PCR. Tento postup je zvláště vhodný pro ověřování odrůdové pravosti u Musa spp., protože umožňuje odhalit konkrétní genotypy nebo jejich směsi v analyzovaných vzorcích.

Na rozdíl od čistého barcodingu, který je často omezený v rozlišovací schopnosti mezi blízce příbuznými kultivary (Osman et al. 2019), poskytují molekulární markery jako SSR a SNP jemnější a ekonomicky dostupnější nástroj pro rutinní testování (Combes et al. 2018; Jungová et al. 2023). Jednou z nejdostupnějších a nejpřesnějších možností je právě využití těchto markerů. Mikrosatelitní SSR markery, jsou vysoce polymorfní, reprodukovatelné a umožňují efektivní rozlišení mezi odrůdami i v rámci geneticky blízkých skupin (Leišová-Svobodová et al. 2023). Jejich výhodou je možnost aplikace v běžně vybavených molekulárních laboratořích, nevýhodou pak složitější interpretace fragmentů a nutnost kapilární elektroforézy. SNP markery představují další významnou kategorii. Díky jejich vysoké hustotě v genomu a možnosti využití automatizovaných platforem jsou vhodné zejména pro analýzu rozsáhlých datasetů (Szczepański et al. 2024). V kombinaci s metodami jako je qPCR nebo digitální PCR umožňují přesnou a rychlou identifikaci, a proto představují ideální nástroj pro inspekční praxi.

Pro obchodní inspekci, která potřebuje praktické a cenově dostupné metody, je zásadní také ekonomické hledisko. SSR markery jsou levnější na zavedení, protože vyžadují pouze PCR a fragmentační analýzu, a nabízejí dostatečně vysokou rozlišovací schopnost. SNP markery jsou sice nákladnější na počáteční investici, avšak při rutinním testování velkého počtu vzorků jsou díky automatizaci a vysoké propustnosti ekonomicky výhodnější. Kombinací obou typů markerů lze navrhnout metodiku, která je spolehlivá, přesná a současně finančně proveditelná.

Prakticky celý proces začíná izolací DNA z listů, slupek nebo dužiny banánu. Pro rod Musa je typický vysoký obsah polyfenolů a sacharidů, které mohou izolaci komplikovat. Proto se nejčastěji využívá CTAB protokol doplněný o PVP a vysokou koncentraci NaCl (Siddique 2014). Získaná DNA se kontroluje pomocí agarózové elektroforézy a spektrofotometrie. Následuje amplifikace cílových fragmentů v PCR reakci, kde lze v praxi výrazně snížit náklady použitím systému M13-tail (Schuelke 2000), tedy kombinace forward primeru s M13 „ocáskem“ a univerzálního fluorescenčně značeného primeru M13 (FAM, VIC, NED, PET) (Jungová et al. 2023). Výsledné fragmenty se vyhodnocují kapilární elektroforézou a analyzují v softwaru, jako je GeneMarker. Dále jsou pro detailní rozlišení vhodné SNP markery, které poskytují jednoznačné polymorfismy a lze je efektivně zapojit do automatizovaných pipeline (např. qPCR sondy, HRM, dPCR nebo nízkonákladové panely). Při větších počtech vzorků se tím výrazně snižují náklady, zvyšuje se propustnost i úroveň standardizace. K potvrzení nebo kvantifikaci se zpravidla využívá 2–4 SNP cílených na rozdílové lokusy, například A/B specifické polymorfismy nebo kultivarově specifické SNP (Szczepański et al. 2024).

V případě barcodingu jsou sekvenované fragmenty porovnávány s databázemi, zatímco u SSR a SNP markerů se sledují polymorfismy v konkrétních lokusech.

Výsledky umožňují kontrolním orgánům rychle a spolehlivě ověřit odrůdovou pravost, identifikovat příměsi a předejít podvodným praktikám. Kombinace DNA barcodingu s využitím SSR a SNP markerů tak nabízí metodiku, která spojuje vysokou spolehlivost, rychlost a ekonomickou efektivitu a je proto vhodná pro rutinní použití v inspekční praxi.

Závěr

Kombinace barcodingu (pro druhový screening a směsi), SSR (pro jemné odrůdové rozlišení) a SNP (pro rychlé, automatizované potvrzení) poskytuje robustní, rychlou a cenově efektivní metodiku pro inspekční praxi. U banánů a plantainů, kde vizuální rozlišení „zelených“ plodů selhává, jde o nejpraktičtější cestu, jak chránit důvěru trhu, sankcionovat falšování a podpořit férový obchod.

Autor: Ing. et Ing. Michaela Jungová, PhD., Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně; Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.

Výsledek vznikl za podpory Ministerstva zemědělství, institucionální podpora MZE-RO0425. 

Literární odkazy

Black C, Haughey SA, Chevallier OP, Galvin-King P, Elliott CT (2016) A comprehensive strategy to detect the fraudulent adulteration of herbs: The oregano approach. Food Chemistry, 210, 551–557. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.05.004

Bruno A, Sandiogini A, Agostinetto G, Bernabovi L, Frigerio J, Casiraghi M, Labra M (2019) Food tracking perspective: DNA metabarcoding to identify plant composition in complex and processed food products. Genes, 10, 248. https://doi.org/10.3390/genes10030248

Cau S, Tilocca M, Spanu C, Soro B, Tedde T, Salza S, Melillo R, Piras G, Virgilio S, Vodret B, Mudadu A (2021) Detection of celery (Apium graveolens) allergen in foods of animal and plant origin by droplet digital PCR assay. Food Control, 130, 108407. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2021.108407

Combes M, Joët T, Lashermes P (2018) Development of a rapid and efficient DNA-based method to detect and quantify adulterations in coffee (Arabica versus Robusta). Food Control, 88, 198–206. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.01.014

Cottenet G, Cavin C, Blancpain C, Chuah PF, Pellesi R, Suman M, Nogueira S, Gadanho M (2022) A DNA metabarcoding workflow to identify species in spices and herbs. Journal of AOAC International, 106, 65–72. https://doi.org/10.1093/jaoacint/qsac099

Cottenet G, Blancpain C, Holzwarth J (2024) A digital PCR approach to assess the purity of oregano. Heliyon, 10(4), e25985. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e25985

Dale J, James A, Paul J, Khanna H, Smith M, Kema G, Waterhouse P, Mengersen K, Harding R (2017) Transgenic Cavendish bananas with resistance to Fusarium wilt tropical race 4. Nature Communications, 8(1), 1–8. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01670-6

Flügge F, Kerkow T, Kowalski P, Bornhoft J, Seemann É, Creydt M, Schütze B, Günther UL (2023) Qualitative and quantitative food authentication of oregano using NGS and NMR with chemometrics. Food Control, 145, 109497. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2022.109497

Hoban CL, Musgrave IF, Coghlan ML, et al. (2018) Adulterants and contaminants in psychotropic herbal medicines detected with mass spectrometry and next-generation DNA sequencing. Pharmaceutical Medicine, 32, 429–444. https://doi.org/10.1007/s40290-018-0252-8

Jungová M, Jurasová Müllerová V, Čepková Hlásná P, Svobodová Leišová L, Svoboda P, Hejcman M (2023) Origin and genetic variability of populations of the invasive plant Rumex alpinus L. in the Giant (Krkonoše) Mountains. Ecology and Evolution, 13, e10145. https://doi.org/10.1002/ece3.10145

Leišová-Svobodová L, Stavělíková H, Zámečník J (2023) Evaluation of genetic diversity and phenotypic description of garlic (Allium sativum L.) from the Czech field collection. Scientia Horticulturae, 323, 112506. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2023.112506

Maseko KH, Regnier T, Meiring B, Wokadala OC, and Anyasi TA (2024) Musa species variation, production, and the application of its processed flour: A review. Scientia Horticulturae, 325, 112688. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2023.112688

Parveen I, Gafner S, Techen N, Murch SJ, Khan IA (2016) DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: Strengths and limitations. Planta Medica, 82(14), 1225–1235. https://doi.org/10.1055/s-0042-111208

Ploetz RC (2015) Management of Fusarium wilt of banana: a review with special reference to tropical race 4. Crop Protection, 73, 7–15. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2015.01.007

Osman AG, Raman V, Haider S, Ali Z, Chittiboyina AG, Khan IA (2019) Overview of analytical tools for the identification of adulterants in commonly traded herbs and spices. Journal of AOAC International, 102, 376–385. https://doi.org/10.5740/jaoacint.18-0389

Siddique R (2014) Optimization of genomic DNA extraction protocol for molecular profiling of banana / plantain (Musa species). European Scientific Journal, 10, ISSN 1857-7431.

Soluri J (2002) Accounting for taste: Export bananas, mass markets, and Panama disease. Environmental History, 7(3), 386–404. https://doi.org/10.2307/3985731

Szczepański S, Łabiszak B, Lasek M, and Wachowiak W (2024) Hybridization has localized effect on genetic variation in closely related pine species. BMC Plant Biology, 24:1007. https://doi.org/10.1186/s12870-024-05732-y

Stover RH (1986) Disease management strategies and the survival of the banana industry. Annual Review of Phytopathology, 24, 83–91. https://doi.org/10.1146/annurev.py.24.090186.000503