Technologie CRISPR/Cas9 zásadně proměnila možnosti rostlinného šlechtění. Umožňuje přesné a cílené zásahy do genomu, které mohou vést k vyšším výnosům, odolnosti vůči chorobám či suchu, a přitom zachovat přirozený charakter plodiny.

Zatímco první generace CRISPR-editací využívala plazmidy nebo bakteriální vektory k expresi Cas9 a vodicí RNA (gRNA), současný vývoj směřuje k metodám, které umožňují úpravy zcela bez cizorodé DNA – tzv. DNA-free přístupům. Tyto technologie otevírají cestu k nové generaci šlechtění, která může být regulačně přijatelná i v rámci přísného evropského právního rámce.

(Text tematicky navazuje na článek doc. Jaroslavy Ovesné „Praktické aplikace genových editací – Rostliny pro budoucnost“.)

Od transgenní k DNA-free editaci

První aplikace technologie CRISPR/Cas9 v rostlinách využívaly plazmidové DNA konstrukty, které obsahovaly geny pro Cas9 nukleázu, vodicí RNA (guide RNA, gRNA) a často také selektovatelné markery pro identifikaci úspěšně transformovaných buněk. Tyto plazmidy byly do rostlinných buněk vnášeny pomocí Agrobacterium tumefaciens, které přirozeně přenáší část své DNA (transfer DNA, T-DNA) do jádra hostitelské buňky, nebo biolisticky, kdy jsou částice zlata či wolframu potažené DNA fyzikálně urychleny do pletiva.

Jakmile se konstrukty dostaly do buňky, exprimoval se gen pro Cas9 a vzniklá nukleáza společně s gRNA provedla cílený řez v genomu. Opravné mechanismy buňky pak místo opět spojily – čímž došlo k editaci. Problémem však bylo, že plazmidová DNA se často náhodně integrovala do genomu, a to i v malých fragmentech nebo v neúplné podobě. I když bylo možné v dalších generacích transgen segregovat, stopa po cizorodé DNA nebo možnost jejího přenosu zůstávala.

Z pohledu evropské legislativy to znamenalo, že takto vzniklé rostliny jsou transgenní, tedy spadají pod definici geneticky modifikovaných organismů (GMO). Rozhodnutí Soudního dvora EU (C-528/16, 2018) výslovně potvrdilo, že organismy získané metodami zahrnujícími rekombinantní DNA podléhají přísným pravidlům pro GMO, i když výsledná rostlina cizí geny nakonec neobsahuje.

Tato právní skutečnost zásadně ovlivnila vývoj směru rostlinné biotechnologie. Začala se hledat řešení, jak dosáhnout přesné editace genomu bez vnesení DNA – tedy tak, aby v buňce působil pouze protein Cas9 a gRNA, nikoli jejich geny. Tento přístup dal vzniknout konceptu DNA-free editace, který dnes představuje nejen technologickou inovaci, ale i cestu k širšímu společenskému a legislativnímu přijetí moderního šlechtění.

Diskuse o DNA-free editaci úzce souvisí s konceptem nových genomických technik (NGT), kam podle Evropské komise patří metody jako CRISPR/Cas9, TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), využívající cílené štěpení DNA specifickými nukleázami, a ODM (Oligonucleotide-Directed Mutagenesis), založená na krátkých oligonukleotidech, které přesně opravují cílové sekvence. (European commision, 2021) Na rozdíl od klasické transgeneze tyto techniky obvykle nevedou k trvalému vložení cizí DNA, ale umožňují přesnou úpravu existujících sekvencí v genomu

Evropská komise v roce 2023 navrhla nové nařízení, které má NGT rostliny vyčlenit z přísného režimu pro geneticky modifikované organismy (GMO), pokud neobsahují žádnou cizí DNA a jejich genetická změna by mohla vzniknout i přirozenou mutací nebo tradičním šlechtěním (Winter, 2024). Takové rostliny by tedy nebyly považovány za GMO, ale za produkty nové generace precizního šlechtění s jednodušším schvalovacím procesem. Ačkoli Evropská komise připravila návrh nového nařízení pro NGT rostliny, legislativní proces zatím nebyl ukončen. Až do jeho vstupu v platnost zůstávají rostliny vytvořené pomocí genových editací pod právním režimem GMO.

DNA-free editace, založená na přímém vnesení RNP (ribonukleoproteinového komplexu) nebo RNA bez integrace DNA, představuje technologii, která plně odpovídá těmto legislativním požadavkům. Je proto považována za klíčový směr budoucího vývoje NGT v rostlinách – umožňuje totiž spojit přesnost genového zásahu s jasně definovaným legislativním statusem.

Vstup editačních komponent do rostlinné buňky

Úspěšnost DNA-free editace do značné míry závisí na typu rostlinného materiálu a na možnosti dostat editační komponenty přes buněčnou stěnu. Rostlinná buněčná stěna je přirozenou bariérou, která ztěžuje průnik velkých molekul, jako jsou proteiny Cas9 nebo RNP komplexy. Proto se v řadě studií používají protoplasty – buňky, kterým byla buněčná stěna enzymaticky odstraněna a do nichž lze RNP nebo RNA snadno zavést pomocí PEG-mediované transfekce nebo elektroporace.

Regenerace rostlin z protoplastů je však často obtížná, časově náročná a druhově specifická. Z tohoto důvodu se výzkum DNA-free editace stále více zaměřuje na využití alternativních typů rostlinného materiálu, které umožňují obejít potřebu odstranění buněčné stěny. Jako vhodné cíle se ukazují zejména mikrospory – haploidní buňky, jež lze snadno přeměnit v embryogenní struktury, pylová zrna a embryonální buňky, jež mají vysoký regenerační potenciál a lze je po úspěšné editaci diferencovat v celé rostliny.

Po biolistickém nebo protoplastovém přenosu RNP může vznikat mozaicismus – stav, kdy různé buňky v jedné rostlině nesou odlišné genotypy v důsledku neúplné nebo časově posunuté editace. Tento jev je způsoben tím, že ribonukleoproteinový komplex Cas9/gRNA působí pouze krátce po vnesení a editace probíhá nezávisle v jednotlivých buňkách. Výsledná rostlina tak může obsahovat směs editovaných a needitovaných buněk. V praxi se proto provádí regenerace a selekce homogenních, plně editovaných linií, které zajišťují stabilitu požadované mutace a její dědičnost v dalších generacích (Andersson et al., 2018; Scintilla et al., 2022)

Ribonukleoproteinové (RNP) komplexy

Základem DNA-free přístupů je přímé dodání ribonukleoproteinového komplexu (RNP), tvořeného purifikovaným proteinem Cas9 a gRNA. Po vstupu do buňky Cas9 provede cílený řez v DNA, aktivuje opravné mechanismy a následně se rozloží, aniž by po sobě zanechal jakýkoli genetický materiál.

RNP editace je velmi přesná a minimalizuje riziko tzv. off-target mutací. Z hlediska doručení do buňky se využívají různé fyzikální a chemické metody, např.:

• PEG-mediated transfekce nebo elektroporace protoplastů,

• biolistická metoda, kdy jsou částice zlata či wolframu potažené RNP urychleny do buněk kalusu či embryí,

Úspěšné využití biolistického zavedení RNP bylo popsáno např. u pšenice, kukuřice či rýže, což vedlo k dědičným mutacím (Svitashev et al., 2016).

Přístupy využívající RNA

Alternativní strategií DNA-free editace je použití RNA místo RNP komplexu. Do buňky se zavádí in vitro transkribovaná mRNA (messenger RNA) kódující Cas9 a gRNA, které jsou následně dočasně exprimovány. Po provedení editace RNA rychle degraduje, čímž se zcela eliminuje možnost integrace DNA. https://forms.cloud.microsoft/pages/responsepage.aspx?id=NIV1JurOGkmr7kWZz8X9wS1z7SaSr7xDvkM7sfoBJitUMEE1RDZGS1lCWTdFUVpURkNEN1dCVFNaWS4u&route=shorturl

Tento přístup lze realizovat biolisticky nebo pomocí liposomálních nosičů. Výhodou je krátkodobá exprese a vysoká přesnost, protože Cas9 působí jen po omezenou dobu. RNA editace byla úspěšně otestována u několika modelových plodin a představuje přechod mezi čistě fyzikálními metodami a biochemickými systémy transientní exprese.(Qiu et al., 2025)

Dalším směrem DNA-free genové editace jsou virové RNA vektory, které umožňují transientní expresi Cas9 a gRNA přímo z virového RNA genomu (Li et al., 2021). Tento přístup, označovaný jako virus-induced genome editing (VIGE), využívá replikující se RNA viry, jako jsou Tobacco rattle virus (TRV), Barley stripe mosaic virus (BSMV), Foxtail mosaic virus (FoMV) nebo Sonchus yellow net virus (SYNV) (Zhang et al., 2022). Tyto viry se replikují výhradně v RNA formě, neprocházejí DNA meziproduktem a neintegrují se do hostitelského genomu, což zajišťuje, že po editaci nezůstává v rostlině žádná cizí DNA.

Po zavedení virové RNA do rostlinné buňky — obvykle mechanickou inokulací, biolistickým zavedením nebo prostřednictvím infekční RNA transkripce — virus spustí dočasnou expresi Cas9 a gRNA. Po provedení cílené editace virová RNA postupně degraduje a rostlina může být regenerována jako zcela DNA-free editovaný jedinec.

Nové technologické směry DNA-free editace

Současný výzkum DNA-free editace se posouvá i mimo tradiční fyzikální a biochemické rámce. Objevují se inovativní technologie, které umožňují efektivnější přenos editačních komponent do rostlinných buněk – a to i bez potřeby tvorby protoplastů.

Nanomateriálové nosiče

Nanomateriály, jako jsou uhlíkové nanotrubice, vrstvené dvojité hydroxidy nebo lipidové nanočástice, mohou sloužit jako vektory pro transport RNP nebo RNA přes buněčnou stěnu. Tento přístup umožňuje přímé zavedení editačních komplexů do intaktních rostlinných pletiv bez nutnosti regenerace z protoplastů (Demirer et al., 2019). Výzkum těchto metod je zatím v rané fázi, ale první výsledky naznačují velký potenciál pro zjednodušení a zrychlení editace u obtížně transformovatelných druhů.

Závěr

DNA-free genová editace představuje novou etapu precizního šlechtění rostlin. Umožňuje provádět cílené zásahy do genomu bez trvalé přítomnosti cizí DNA, čímž eliminuje jednu z hlavních překážek legislativního a etického charakteru. Kombinace biolistické editace RNP, RNA-založených přístupů a využití buněk s embryogenním potenciálem nabízí nové možnosti pro tvorbu geneticky upravených rostlin s jasně definovaným molekulárním profilem. Přesto zůstává výzvou optimalizace účinnosti editace, regenerace a přenositelnosti těchto metod mezi různými druhy rostlin, což bude klíčové pro jejich širší uplatnění v praxi i pro budoucí legislativní vymezení NGT v Evropě

Autor: Mgr. Štěpán Helmer

CARC , Drnovska 507, 160 00 Praha 6

Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.

Výsledek vznikl za podpory Ministerstva zemědělství, institucionální podpora MZE-RO0425.

Citace:

Andersson, M. et al. (2018) ‘Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery’, Physiologia Plantarum, 164(4), pp. 378–384. Available at: https://doi.org/10.1111/ppl.12731.

Demirer, G.S. et al. (2019) ‘Carbon nanotube–mediated DNA delivery without transgene integration in intact plants’, Nature Protocols, 14(10), pp. 2954–2971. Available at: https://doi.org/10.1038/s41596-019-0208-9.

Li, T. et al. (2021) ‘Highly efficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassing tissue culture’, pp. 1787–1798.

Qiu, F. et al. (2025) ‘An efficient mRNA delivery system for genome editing in plants’, Plant Biotechnology Journal, 23(4), pp. 1348–1358. Available at: https://doi.org/10.1111/pbi.14591.

Scintilla, S. et al. (2022) ‘Regeneration of non-chimeric plants from DNA-free edited grapevine protoplasts’, Frontiers in Plant Science, 13(December), pp. 1–11. Available at: https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1078931.

Svitashev, S. et al. (2016) ‘Genome editing in maize directed by CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein complexes’, Nature Communications, 7(1), p. 13274. Available at: https://doi.org/10.1038/ncomms13274.

Winter, G. (2024) ‘The European Union’s deregulation of plants obtained from new genomic techniques: a critique and an alternative option’, Environmental Sciences Europe, 36(1). Available at: https://doi.org/10.1186/s12302-024-00867-z.

Zhang, C. et al. (2022) ‘Virus-Induced Gene Editing and Its Applications in Plants.’, International journal of molecular sciences, 23(18). Available at: https://doi.org/10.3390/ijms231810202.

 European Commission (2021). Study on the status of new genomic techniques under Union law and in light of the Court of Justice ruling in Case C-528/16. Accompanying the Communication COM(2021) 92 final. Brussels: European Commission. Available at: https://food.ec.europa.eu/system/files/2021-04/gmo_mod-bio_ngt_eu-study.pdf