Mikroorganismy patřily k prvním organismům, které člověk nevědomky využíval při výrobě potravin. Kvasinky zajišťují kvašení vína, piva či chleba, bakterie přeměňují mléko na jogurt a sýry a další druhy jsou zdrojem enzymů, vitamínů a aromatických látek.

V posledních desetiletích se z mikroorganismů staly cíleně šlechtěné „buněčné továrny“ schopné produkovat širokou škálu látek důležitých pro potravinářství i průmysl. Dříve probíhal jejich vývoj převážně pomocí náhodné mutageneze, výběru a klasického genetického inženýrství. S nástupem nových genomických technik (NGT), zvláště CRISPR-Cas systémů, se otevřela možnost provádět zásahy přesně, rychle a bez zavedení cizorodé DNA. Tyto techniky dnes umožňují vytvořit mikroorganismy s přesně upravenými vlastnostmi – například s vyšší odolností, vyšší produkcí metabolitů nebo s odstraněnými nežádoucími geny. Tento rychlý technologický vývoj však před evropské regulační orgány i laboratorní praxi staví zásadní otázku: jak takové mikroorganismy spolehlivě detekovat a rozlišit od těch, které vznikly přirozeně?

Základní problém detekce NGT mikroorganismů spočívá v tom, že většina nových genomických technik nevede k zavedení dlouhých unikátních sekvencí, ale k často drobným změnám v podobě jednoho či několika mála nukleotidů. Takové změny, označované jako SNV (Single Nucleotide Variant) nebo krátké inserce a delece, mohou vzniknout i samovolně v důsledku mutací, které se u mikroorganismů objevují velmi často a rychle. Práce Arnolda a spoluautorů (2021) ukazuje, že bakterie jsou schopny horizontálního přenosu genetické informace, což výrazně přispívá k jejich genetické variabilitě. Přirozené mutace i horizontálně přenesené geny tak mohou imitovat specifické změny vytvářené pomocí NGT, což činí jejich odlišení velmi obtížným. Stejně tak pan-genomické studie (Medini et al., 2005) potvrzují, že genom jednoho druhu může vykazovat obrovskou variabilitu nejen mezi vzdálenými kmeny, ale i mezi mikroorganismy izolovanými z různých potravinářských provozů. Z toho vyplývá, že detekce změny na úrovni jednoho nukleotidu nemůže bez znalosti původu kmene prokázat použití konkrétní technologie.

Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) již dříve rozdělil produkty pocházející z geneticky modifikovaných mikroorganismů do několika kategorií (EFSA GMO Panel, 2011). Z pohledu analytické detekce jsou klíčové kategorie tři a čtyři. Do třetí skupiny spadají produkty, které sice neobsahují živé mikroorganismy, ale stále obsahují jejich DNA – například inaktivované kultury nebo biomasa sloužící jako zdroj bílkovin. Čtvrtá skupina zahrnuje produkty obsahující živé mikroorganismy, typicky probiotika či fermentační kultury. V obou případech je možné využít metody založené na analýze DNA, a to buď za účelem potvrzení přítomnosti mikroorganismu, nebo za účelem identifikace konkrétní genetické úpravy. Situace je však mnohem složitější než u rostlin, protože mikroorganismy běžně nesou mnoho mobilních genetických elementů, mají vysokou rychlost mutací a v přírodě dochází k častému přenosu genetických informací mezi nepříbuznými organismy (Del Duca et al., 2022).

Mezi základní analytické přístupy patří polymerázová řetězová reakce. PCR, real-time PCR a digitální PCR se v evropských kontrolních laboratořích využívají již řadu let a jejich výhodou je rychlost a robustnost. Pro detekci NGT mikroorganismů jsou však použitelné pouze tehdy, pokud úprava vytváří dostatečně dlouhou a unikátní sekvenční signaturu. Pokud se jedná o malou změnu, možnost konstrukce spolehlivého PCR testu se výrazně snižuje. Hommelsheim a kolektiv (2014) například upozorňují, že repetitivní oblasti nebo oblasti s vysokým obsahem G/C mohou specifické rozlišení krátkých mutací zcela znemožnit. PCR navíc sama o sobě nedokáže rozlišit, zda detekovaná mutace vznikla cílenou editací, nebo spontánně, což ve většině případů vylučuje možnost využít PCR jako důkaz o aplikaci NGT.

Zájem proto přirozeně směřuje k vysokokapacitnímu sekvenování (HTS, High-Throughput Sequencing). HTS, a zejména sekvenování celého genomu (WGS, Whole Genome Sequencing), umožňuje získat kompletní genetický profil mikroorganismu. Zkušenosti z oblasti epidemiologie potravinových patogenů (např. Allard et al., 2016; Nouws et al., 2021) ukazují, že WGS je mimořádně účinným nástrojem pro rozlišování velmi blízkých kmenů. U mikroorganismů se sekvenování jeví jako perspektivní metoda i pro oblast GMO kontroly, neboť jejich genomy jsou ve srovnání s rostlinami malé a snadno analyzovatelné. Nicméně přetrvávají zásadní limity. Úspěšná identifikace konkrétního NGT mikroorganismu vyžaduje přístup k jeho referenční sekvenci, což je problém zejména u mikroorganismů vyvíjených mimo EU. Hurel a kol. (2020) upozorňují na to, že aktuální databáze mikrobiálních genomů často obsahují neúplné nebo špatně anotované záznamy, což znesnadňuje porovnávání a interpretaci výsledků. Další potíž představuje skutečnost, že sekvenování stále nedokáže vyřešit otázku původu malé mutace – tedy zda byla vytvořena přirozeně, nebo pomocí NGT.

Komplikace dále narůstají u potravinových produktů obsahujících směsi různých mikroorganismů. Metagenomické studie ukázaly, že rozlišení jednotlivých kmenů v komplexním vzorku je technologicky i bioinformaticky náročné (Buytaers et al., 2020). I když některé studie zdůrazňují pokrok v této oblasti (Ahlinder et al., 2022), rutinní využití pro účely kontroly NGT mikroorganismů je zatím nereálné. Současné metody také neumožňují přesné kvantifikace NGT mikroorganismů v potravinách, protože většina sekvenačních protokolů obsahuje amplifikační kroky, které ovlivňuje přesnost měření (Arulandhu et al., 2018; Debode et al., 2019).

Detekce mikroorganismů upravených pomocí NGT je tedy zatížena několika rovinami nejistoty. Tou první je biologická variabilita mikroorganismů, která znemožňuje vytvoření univerzálního referenčního genomu. Druhou je rychlost evoluce a přítomnost mobilních genetických elementů, které mohou podobné nebo identické mutace šířit v populaci zcela nezávisle na lidském zásahu. Třetím problémem je samotná povaha většiny NGT úprav – jde často o malé změny, které nedávají vznik unikátním genetickým rozhraním. Bez toho není možné vytvořit tzv. event-specific test, který je základním požadavkem současné GMO legislativy.

Současný technologický stav umožňuje spolehlivě detekovat pouze ty NGT mikroorganismy, které nesou dostatečně velké a unikátní genetické změny. U většiny organismů založených na drobných editacích však detekce není možná bez znalosti přesné sekvence úpravy. Do budoucna tak bude pravděpodobně nutné propojit laboratorní analytiku s rozsáhlými genomickými databázemi, patentovými informacemi, znalostmi o vývoji v jednotlivých firmách a s bioinformatickými nástroji schopnými rozpoznávat vzorce editací u různých taxonomických skupin mikroorganismů. Jedině kombinace těchto přístupů může vytvořit systém, který bude schopný udržet krok s rychle rostoucím počtem nových genomicky upravených mikrobiálních produktů.

Autor:

Ing. Tereza Sovová, PhD.

Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně

Tato e-mailová adresa je chráněna před spamboty. Pro její zobrazení musíte mít povolen Javascript.

Výsledek vznikl za podpory Ministerstva zemědělství, institucionální podpora MZE-RO0425.

Reference:

Ahlinder, J., Svedberg, A.-L., Nystedt, A., Dryselius, R., Jacobsson, K., Hägglund, M., Brindefalk, B., Forsman, M., Ottoson, J., Troell, K. (2022). Use of metagenomic microbial source tracking to investigate the source of a foodborne outbreak of cryptosporidiosis. Food and Waterborne Parasitology 26, e00142.

Allard, M.W., Strain, E., Melka, D., Bunning, K., Musser, S.M., Brown, E.W., Timme, R. (2016). Practical value of food pathogen traceability through building a whole-genome sequencing network and database. Journal of Clinical Microbiology 54(8), 1975–1983.

Arulandhu, A.J., van Dijk, J.P., Staats, M., Hagelaar, R., Voorhuijzen, M., Molenaar, B., Frese, K., Kok, E.J., Wulff, D. (2018). Nucleotide sequence-based approaches for the detection and identification of genetically modified organisms and derived products. Analytical and Bioanalytical Chemistry 410(21), 5605–5629.

Arnold, B.J., Huang, I.T., Hanage, W.P. (2022). Horizontal gene transfer and adaptive evolution in bacteria. Nature Reviews Microbiology 20, 206–218.

Buytaers, F.E., du Jardin, P., Delvigne, F., Francis, F., Haubruge, E., de Pauw, E., Ongena, M. (2020). Metagenomics-based approach to detect microbial contaminants in food fermentation processes. Food Microbiology 89, 103410.

Debode, F., Hulin, J., Charloteaux, B., Coppieters, W., Hanikenne, M., Karim, L., Francis, F., Ongena, M. (2019). Detection and identification of transgenic events by next generation sequencing combined with enrichment technologies. Scientific Reports 9, 15595.

Del Duca, S., Vassallo, A., Mengoni, A., Fani, R. (2022). Microbial genetics and evolution. Microorganisms 10, 1274.

EFSA Panel on Genetically Modified Organisms (EFSA GMO Panel) (2011). Scientific Opinion on Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use. EFSA Journal 9(6), 2193.

Hommelsheim, C.M., Frantzeskakis, L., Huang, M., Ülker, B. (2014). PCR amplification of repetitive DNA: a limitation for detection and genotyping. Scientific Reports 4, 5050.

Hurel, C., Güldener, U., Xu, H., et al. (2020). (Reference as listed in PDF: microbial genome database challenges.)

Lopera, C., Salazar, M., Almeida, P.G., et al. (2023). (Reference as listed in PDF: microbial pangenomics overview.)

Medini, D., Donati, C., Tettelin, H., Masignani, V., Rappuoli, R. (2005). The microbial pan-genome. Current Opinion in Genetics & Development 15(6), 589–594.

Nouws, S., Bogaerts, B., Verhaegen, B., et al. (2021). Whole-genome sequencing for foodborne outbreak investigation: state of the art. Food Control 123, 107737.

Shillito, R.D., Wolt, J.D., Watson, A., et al. (2021). Genome edited organisms and challenges for detection. Transgenic Research 30, 301–317.