Informace o šlechtění řepky olejky pomocí resyntézy a embryo rescue.

Autor: Ing. Miroslav Klíma, Ph.D., Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i..

Řepka olejka (Brassica napus L. ssp. oleifera) patří mezi nejdůležitější olejniny. Z hlediska globální produkce oleje je na třetím místě za palmou olejnou a sójou, v Evropě jde o olejninu klíčovou. Intenzivním šlechtěním řepky dochází k neustálému zlepšování výnosu semene a dalších agronomických vlastností. Šlechtění je v současnosti zaměřeno nejen na tvorbu vysoce výnosných odrůd, ale také na specifické složení mastných kyselin v oleji, zvýšenou rezistenci vůči významným chorobám a abiotickým stresům, nabývá na důležitosti i šlechtění na adaptabilitu ke specifickým půdně-klimatickým podmínkám. Jedním z nejdůležitějších předpokladů tvorby výkonných odrůd se ukazuje dostatečná genetická variabilita výchozích materiálů, protože dlouhodobé šlechtění na relativně úzký okruh vlastností u řepky postupně vede k zužování genetické diverzity šlechtitelských materiálů.

Řepka olejka vznikla s největší pravděpodobností spontánním mezidruhovým křížením brukve řepáku (řepice, B. rapa) a zelné brukve (B. oleracea) nejspíše již v prehistorické době. Nelze ale mluvit o zkřížení v klasickém slova smyslu, které závisí na spárování příslušných chromozómů od obou rodičů. Chromozómy řepice a brukve se vzájemně nepárují, výsledkem oplození je tak zygota řepky se sádkou chromozómů, odpovídající prostému součtu chromozómů obou pohlavních buněk (gamet) řepice a brukve, tj. n = 10 + 9 = 19. Protože každý chromozóm je v této zygotě zastoupen jen v jednom exempláři, jde o hybrid pouze s polovičním (haploidním) počtem chromozómů, podobně jako tomu je u gamet rodičů. Pravděpodobně již v počátečních fázích vývoje haploidního embrya však může dojít k samovolnému zdvojení chromozómové sádky, čímž embryo získá normální (diploidní) počet chromozómů 2n = 2 x 19 = 38. Protože přírodní populace řepky neexistují, dá se předpokládat, že spontánní vznik řepky výše uvedeným způsobem byl unikátní jev. Z tohoto důvodu také není možné pro obohacení genofondu – na rozdíl od dalších významných plodin – použít „plané“ řepky z přírodních sběrů.

I proto byly v minulosti učiněny pokusy o umělé znovuvytvoření (tzv. resyntézu) řepky hybridizací brukve a řepice, nejprve v polních podmínkách. Zástupci výchozích komponent pro resyntézu (B. rapa – řepice, vodnice a B. oleracea – kadeřávek, zelí, kedluben, kapusta, květák, brokolice apod.) se totiž vyznačují širokou variabilitou z hlediska morfologie i agronomických charakteristik a představují perspektivní zdroj heteróze a dalších znaků. I když byly experimenty úspěšné, počet takto získaných, životaschopných a fertilních řepek byl velmi nízký. Proces je komplikován jak nutností zdvojit chromozómovou sádku haploidní rostliny, tak i nefunkčností endospermu vznikajícího semene, který není schopen zárodek vyživovat a embryo odumírá již v počátečních fázích vývoje. Značný posun přineslo až využití in vitro biotechnologií, o kterých bude pojednáno v následujících odstavcích.

Postup křížení:

Výchozí otcovské a mateřské rostliny brukve a řepice jsou před začátkem kvetení umístěny do podmínek s řízenou teplotou, světelnou intenzitou a fotoperiodou (fotoperioda 16/8 h, teplota den/noc 18/14 °C, intenzita osvětlení 84 μmol/m2/s), aby byl zajištěn optimální vývoj pylových zrn, resp. minimalizován vliv prostředí na rychlost a rovnoměrnost vývoje embryí v šešulích. Otcovské rostliny (B. oleracea) jsou před začátkem kvetení jednotlivě izolovány např. ve vacích z netkané textilie, aby nedošlo ke kontaminaci pylu jejích květů pylem z dalších otcovských nebo mateřských komponent. Před započetím křížení je třeba odstranit květy mateřské rostliny, aby se zabránilo nežádoucímu sprášení pylem z okolních květů. Po otevření poupat mateřské rostliny (B. rapa) a odstranění všech šesti prašníků pinzetou následuje přenesení pylu z květů otcovské rostliny (např. smotkem buničité vaty) na blizny mateřské rostliny. Aby byla vyloučena možnost nežádoucího opylení, je třeba dbát na desinfekci rukou a nářadí, např. 70% roztokem etanolu. Po opylení jsou jednotlivá květenství izolována sáčkem z celofánu, ten fixován kancelářskými sponkami ke květnímu stvolu nebo nejbližšímu listu a křížení označeno identifikačním štítkem (datum křížení, identifikace otcovské rostliny a počet opylených poupat).

Postup tzv. embryo rescue:

Jedenáctý den po opylení jsou jednotlivé šešule i se stopkou odstřiženy z mateřské rostliny, umístěny do kádinky a přeneseny do laboratoře v cestovní chladničce. V laminárním boxu proběhne povrchová sterilizace šešulí 70% etanolem 2 min., následovaná 20% roztokem SAVA 20 min. Po opláchnutí šešulí sterilní chlazenou destilovanou vodou (3 cykly po 5 minutách) jsou šešule na filtračním papíru pod binokulární lupou podélně naříznuty ostrým skalpelem, nezralá vajíčka šetrně vyjmuta jemnou pinzetou nebo preparační jehlou a přenesena na povrch kultivačního média DM v Erlenmeyerových baňkách. Po uzavření baněk jsou nádobky přeneseny do kultivační místnosti s řízeným režimem (fotoperioda den/noc 16/8 h, světelná intenzita 250 μmol/m2/s, 25 °C). První embrya se objevují zhruba 20–30 dní po izolaci. Zelená embrya od délky 2–3 mm jsou přenášena na čerstvé DM médium. Výše uvedený postup se nazývá embryo rescue, protože embrya jsou „zachraňována“ na umělých živných půdách, nahrazujících nefunkční endosperm semene. Úspěšnost embryo rescue závisí jak na šetrnosti manipulace s izolovanými nezralými vajíčky, tak na kombinaci výchozích rodičů (tj. genotypu). Pro získání alespoň jednoho embrya je obvykle třeba kultivovat nezralá vajíčka z 1–3 šešulí.

Postup regenerace rostlin a klonování:

Jakmile embrya dosáhnou délky cca 8–10 mm, jejich děložní lístky jsou z 1/2 až 2/3 odříznuty pro podpoření vývoje vrcholového (apikálního) meristému. Následuje přenos ořezaných embryí na médium RM a snížení teploty v kultivační místnosti z 25°C na 19°C. Rostliny s 1–2 pravými lístky jsou přemístěny na čerstvé RM médium, rostliny ve fázi 3–5 pravých lístků pak na MS médium. Protože všechny takto regenerované rostliny mají poloviční počet chromozómů, je u nich třeba provést již zmíněné zdvojení chromozómové sádky. Jelikož se tento proces neobejde bez citelných ztrát rostlinného materiálu, je doporučováno jednotlivé rostliny ještě v in vitro podmínkách namnožit klonováním z nodálních segmentů. Obvyklý postup je příčné rozdělení stonků rostlin v místech nad a pod spícím očkem s následnou regenerací rostlin z oček segmentů na MS médiu. Jako dostatečný počet pro dopěstování alespoň jedné životaschopné rostliny se zdvojenou sádkou chromozómů do fáze kvetení se uvažuje cca 10 ks naklonovaných jedinců.

Postup zdvojení chromozómové sádky a dopěstování rostlin:

Rostliny jsou vyjmuty z kultivačních nádob, opláchnuty pod vlažnou tekoucí vodou pro odstranění zbytků agarového média. Následuje krátké osušení regenerantů na filtračním papíru, ponoření celých rostlinek do 0,05% roztoku kolchicinu, zakrytí nádoby potravinářskou fólií a umístění do kultivační místnosti do 25°C na 24 hod. Poté jsou rostliny opláchnuty pod mírným proudem vlažné vodovodní vody, ponořeny do 0,15 % roztoku Previcuru na 20 minut, vysázeny do květníků s výsevním substrátem (nebo perlitem) a umístěny do přepravky. Aby se zabránilo vadnutí rostlin, květníky v přepravce musí být po dobu 7–10 dní zakryty perforovanou fólií. Následuje dopěstování rostlin konvenčními postupy (přesazování do větších nádob, jarovizace – pokud alespoň jeden z rodičů byl ozimého typu, průběžná izolace celých rostlin nebo jednotlivých květenství před počátkem kvetení izolačními sáčky, odstraňování sterilních rostlin bez prášivého pylu a u rostlin s neschopností samoopylení v květu – obvykle z důvodu autoinkompatibility – ruční opylování v poupěti. Rostliny se v průběhu dopěstování pravidelně přihnojují a kontroluje jejich zdravotní stav, příp. se ošetřují proti chorobám a škůdcům. K největším ztrátám obvykle dochází ve fázi převodu ze sterilních do nesterilních podmínek, protože jsou rostliny od počátku navyklé na prostředí 100% vzdušné vlhkosti bez přítomnosti patogenů a udržované v ideálních světelných, teplotních a výživových podmínkách. Ztráty lze v případě dobré kondice in vitro rostlin, šetrnou manipulací před/po zdvojování sádky a při vysazování, a umístěním do vhodných podmínek udržet pod 20 %. Při zanedbání i jedné z výše uvedených náležitostí počet rostlin nezřídka klesne na 0–30 % výchozího počtu. Úspěšnost zdvojení chromozómové sádky haploidů (tzv. dihaploidizace) je obvykle 30–60 %, limitující okolností pro získání fertilních rostlin je však vhodná kombinace výchozích rodičů. Velmi často se stává, že z důvodu nekompatibility genotypů jsou všechny rostliny z dané kombinace buď sterilní, nebo mají poruchy fertility, nesouvisející s ploidií (neprášivý pyl, zakrnělé blizny, nízká nebo žádná násada semen apod.).

I když využití resyntetizovaných genotypů k přímé tvorbě odrůd řepky olejky není možné zejména z důvodu horší produktivity a dalších důležitých agronomických vlastností, v našich experimentech i na pracovišti šlechtitelů již bylo ověřeno, že požadované vlastnosti lze přenést křížením z resyntetizovaných řepek do konvenčních šlechtitelských materiálů. Unikátnost resyntézy řepky spočívá především v tom, že lze vytvořit zcela nové genotypy s vlastnostmi, které v současnosti nemusí být k dispozici v dosažitelném genofondu (odrůdy, šlechtitelské materiály, položky genové banky). Může se jednat např. o odolnost k suchu a chorobám, rychlejší růst v podzimním období, specifická kvalita oleje, netradiční habitus rostlin apod. Biotechnologické postupy, zavedené a optimalizované na našem pracovišti lze tak úspěšně využít k rozšíření diverzity genofondu této strategické plodiny.

Problematika byla podpořena projekty Mze ČR č. QJ1510172 a MZE-RO0418



1- Květenství se šešulemi řepice 11 dní po vzdálené hybridizaci, v den odběru
2- Šešule řepice s nezralými vajíčky
3- Nezralá vajíčka řepice po izolaci na tuhém médiu DM
4- Zygotické embryo v časném kotyledonárním stádiu 26 dní po izolaci
5- Kotyledonární embryo 33 dní po izolaci
6- Embryo 40 dní po izolaci
7- Embryo 50 dní po izolaci, na čerstvém DM médiu
8- Regenerace prvního pravého listu 55 dní po izolaci
9- Počátek regenerace rostliny z embrya 2 měsíce po izolaci, na tuhém médiu RM
10- Dobře vyvinutý první pravý list – kříženec řepice "Bulharská" a kadeřávek "Frosty"
11- Regenerant křížence řepice "Svalöfs Duro" a kadeřávku "Frosty" 3 měsíce po izolaci
12- Regeneranty po aplikaci kolchicinu, vysázené v nesterilních podmínkách (perlit)
13- Regenerant resyntetizované řepky (řepice "Brachina" × kadeřávek "Kadeřávek zelený")
14- Morfologie listů výchozích rostlin a z nich resyntetizovaného genotypu (uprostřed)
15- Morfologie rostlin výchozích rostlin a z nich resyntetizovaného genotypu (vlevo nahoře)
16- Kvetoucí resyntetizovaná řepka (vodnice "Tokyo Cross" × červené zelí "Vysocké")
17- Detail fertilního květu (řepice "Arktus" × kadeřávek "Pentland Brig")
(autor fotografií: M. Klíma)